El hecho de que las moléculas de ADN obtenidas al finalizar la reacción en cadena correspondan efectivamente al fragmento de interés queda asegurado por la intervención de los primers que definen los extremos "derecho" e "izquierdo" de ese fragmento. Así, una vez que la reacción a finalizado, el tamaño del fragmento multiplicado puede determinarse sometiendo los productos de la reacción a una electroforesis en gel de agaroza o poliacrilamida, es decir, a un proceso de separación por difusión bajo la acción de un campo eléctrico. Por otra parte, la identidad del producto puede ser confirmada mediante hibridación (unión complementaria) con una sonda marcada radiactivamente, cuya secuencia de bases esté contenida en el fragmento de interés. En este caso se procede así: el ADN fraccionado por electroforesis es desnaturalizado y luego transferido a una membrana de nitrocelulosa o nylon, que actúa como soporte sólido (Southern blot), y luego es puesto en contacto con la sonda, que se unirá al fragmento buscado ya que ha sido preparada de modo tal que resulta ser complementaria del mismo. También es posible colocar el ADN directamente en la membrana en forma de pequeñas manchas (dot blot) para su posterior hibridación con la sonda (véase la figura 2). La localización de las sondas radiactivas se logra, en ambos casos, mediante autorradiografías (véase "Las sondas de ácidos nucleicos" en Ciencia Hoy, vol. 4, nº 20, págs. 46-51).

Figura 2. Tres formas de analizar los fragmentos de ADN amplificados mediante la técnica PCR. A: visualización directa. Las muestras colocadas sobre un gel y sometidas a la acción de un campo eléctrico (electroforesis) migran de una manera característica que se puede visualizar por tinción (coloreado) del ADN. (Carriles 1-8: productos de distintas PCRs; carril M: marcadores de ADN de tamaño conocido.) B: Southern blot. El ADN es desnaturalizado (separación de sus hebras constituyentes) y transferido a una membrana de nitrocelulosa o nylon para luego incubar la hibridación (unión) con una sonda radiactiva. Ésta quedará fijada donde se encuentre el tramo de ADN de interés y su presencia se revelará a través de una autorradiografía (placa fotográfica sensible a la emisión radiactiva de la sonda). C: dot blot. Método análogo al anterior, pero practicado sobre una siembra en forma de manchas de los fragmentos de ADN a analizar previamente desnaturalizados.

Una estrategia distinta para confirmar la identidad del fragmento replicado consiste en realizar dos reacciones de PCR consecutivas. Al finalizar la primera, una alícuota de la misma es sometida nuevamente al proceso de multiplicación tras haber colocado dos primers internos. Mediante el empleo de esta metodología, conocida como nested PCR (PCR anidada), la filiación de los fragmentos obtenidos queda confirmada por el hecho de que poseen tamaños previsibles.

En algunos casos, los productos amplificados poseen secuencias que son reconocidas y clivadas por ciertas enzimas llamadas en donucleasas de restricción. La determinación del tamaño al que quedan reducidos los fragmentos al ser puestos en contacto con la enzima de restricción adecuada indica que nos encontramos ante los segmentos de interés.

Para diseñar los primers que hacen posible replicar un fragmento de ADN mediante la técnica PCR es necesario conocer, en la mayoría de los casos, la secuencia de bases total o parcial de dicho fragmento. Por esta razón, aunque la PCR supera en sensibilidad y rapidez a las técnicas de clonado y de secuenciación convencionales, no se puede prescindir de la información brindada por las mismas.

PLICACIONES EN LA INVESTIGACIÓN BÁSICA

Nuestro conocimiento de la estructura y función de los genes surge en gran medida de la determinación de su secuencia de bases. La secuenciación directa y el grado de multiplicación permitidos por la técnica PCR constituyen aportes esenciales de esta metodología a la investigación básica en biología molecular, ya que facilitan la tarea haciéndola más rápida y eficiente. Aunque los fragmentos de ADN de cadena doble obtenidos por amplificación pueden ser usados como moldes para una posterior secuenciación, resulta más conveniente utilizar cadenas simples. Cabe señalar que por el solo hecho de agregar en la reacción base un exceso de uno de los primers se puede lograr que una de las dos cadenas del ADN desnaturalizado se multiplique diez veces más que la otra.

El análisis de los niveles de los distintos ARN mensajeros (ARNm) presentes en una célula ha sido realizado tradicionalmente mediante procedimientos que incluyen los Northern (el Southern para ARN) y dot blot o la hibridación in situ (sobre la función del ARNm véase "Somera descripción del ADN"). La importancia de este tipo de análisis se debe a que esos niveles de ARNm, que son principalmente el resultado del control de la transcripción de los genes, reflejan el estado de desarrollo y diferenciación de la célula. La aplicación de la PCR ha dado lugar a una nueva modalidad para analizar el ARNm. Éste es aislado, en primer lugar, de tejidos o células y entonces se lo utiliza como molde para la fabricación de un ADN complementario (cADN) por parte de la enzima transcriptasa reversa (el calificativo de reversa aplicado a esta enzima se debe a que su acción es "inversa" a la cumplida por la enzima transcriptasa, que produce ARN a partir de ADN). El cADN así obtenido es usado a su vez como molde que se replicará mediante la PCR, tras la aplicación de primers diseñados para delimitar la región que resulta de interés. El control adecuado de todos los pasos de estas reacciones hace posible cuantificar con precisión los niveles de ARNm originales. La alta sensibilidad que caracteriza al método, llamado en esta variante RT-PCR (por Reverse Transcriptase-PCR), permite su uso en la detección y cuantificación de ARN mensajeros poco abundantes.

La técnica PCR puede ser utilizada, en algunos casos, para clonar genes cuya secuencia de bases es desconocida. Cabe preguntarse cómo se diseñan, en este caso, los primers necesarios para realizar la amplificación. La respuesta a esta pregunta la da el conocimiento del código genético (véase "ADN, esa molécula maravillosa", particularmente el recuadro titulado `El lenguaje de la vida', en Ciencia Hoy, vol. 2, nº 8, págs. 26-35). Si se determina experimentalmente la secuencia de aminoácidos que constituyen un segmento de la proteína cuyo gen se quiere clonar, se puede deducir cuáles son las secuencias teóricas de todos los posibles ARN mensajeros que codifican para ese segmento. Con esta información se fabrican los dos primers, cada uno de los cuales es, en realidad, una mezcla de todos los oligonucleótidos posibles que el código genético permite deducir para codificar el segmento de proteína elegido. Se habla de "degeneración" del código genético aludiendo precisamente al hecho de que dada una secuencia de aminoácidos no se puede deducir con certeza la secuencia de nucleótidos que la codifica, ya que varias de ellas cumplen la misma función. Dicho de otro modo: varias secuencias de nucleótidos pueden dar lugar a un mismo aminoácido. La reacción de PCR se realiza con estas dos mezclas de "primers degenerados". En cada mezcla, sólo uno de los oligonucleótidos será totalmente complementario del fragmento de ADN a amplificar y funcionará realmente como primer. Una vez amplificado el fragmento, se estudia la secuencia y se comprueba su correspondencia con la de la proteína previamente caracterizada.

Señalemos por último que la técnica PCR puede ser utilizada para cambiar la información contenida en un segmento de ADN, pues permite alterar su secuencia de bases. Esta "mutagénesis dirigida" consiste en el reemplazo de la secuencia génica original por otra, que puede diferir, por ejemplo, en una base respecto de la original. Esto se logra usando primers que, a pesar de portar la mutación, son igualmente capaces de aparearse con el molde y dar lugar a productos de amplificación con la secuencia cambiada.

La PCR ha permitido el desarrollo de nuevas estrategias de diagnóstico en numerosos campos de la medicina. Por ejemplo, existen métodos de detección por PCR de agentes infecciosos como los virus de las hepatitis B y C, del papiloma humano, de Epstein Barr y citomegálico. En relación con el SIDA es posible detectar regiones del genoma del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) amplificadas por PCR a partir de sangre extraída de pacientes seropositivos. Esta técnica puede ayudar a resolver resultados inciertos provenientes de las pruebas habituales y ha sido aplicada en el diagnóstico de la infección en recién nacidos de madres seropositivas. En tales casos, el uso de la técnica PCR evita el problema que se plantea por el hecho de que la presencia de anticuerpos recibidos de la madre impide saber, hasta que éstos desaparecen aproximadamente un año después del nacimiento, si el propio organismo del niño ha generado anticuerpos porque se encuentra infectado (véase "El niño infectado con HIV', en Ciencia Hoy, vol. 4, nº 21, págs. 46-47). Pueden detectarse también otros microrganismos patógenos como las clamidias, la bacteria Escherichia coli enterotoxigénica, el vibrión del cólera y los tripanosomas.

La técnica PCR ha facilitado enormemente el diagnóstico de enfermedades hereditarias como hemoglobinopatías (talasemias y anemia falciforme), la fenilcetonuria, las hemofilias A y B, la deficiencia de alfa 1 antitripsina, la distrofia muscular y la fibrosis quística. Esta última es la más común de las enfermedades autosómicas recesivas severas que afectan a la población blanca. El aislamiento del gen afectado ha permitido identificar las mutaciones que causarían esta patología. La anulación de tres bases que provocan la ausencia del aminoácido fenilalanina N° 508 en la proteína que es producto del gen de la fibrosis quística constituye la mutación -llamada DF508- más frecuente en caucásicos (60% de los afectados en la población argentina), por lo que su análisis resulta ser el primer paso destinado tanto a la detección de portadores sanos como a la confirmación del diagnóstico en individuos afectados y al diagnóstico prenatal. La figura 3 muestra el ensayo de PCR utilizado para detectar la mutación DF508: se replica un segmento del gen de la fibrosis quística que comprende la zona que codifica para la fenilalanina 508. Los productos de la PCR son inmovilizados por duplicado en forma de manchas en dos filtros de nitrocelulosa (dot blot). Uno de los filtros es hibridado con una sonda (un oligonucleótido) marcada que se corresponde con el gen normal, mientras que el otro es hibridado con una sonda correspondiente al gen mutado. Las hibridaciones se realizan en condiciones experimentales destinadas a garantizar que la sonda normal sólo se apareará con el ADN normal amplificado y que la sonda mutada sólo lo hará con el ADN mutado amplificado. De esta manera, el análisis de las rnanchas de hibridación reveladas en la autorradiografía permitirá reconstruir el genotipo de los pacientes.

En enfermedades oncológicas pueden detectarse, mediante la técnica PCR, mutaciones de oncogenes (literalmente "genes inductores de cáncer") como en el caso del oncogén ras en carcinomas de colon, de páncreas y en leucemias mieloides; del "antioncogén" de retinoblastma, o del llamado cromosoma Philadelphia. Este cromosoma aparece en pacientes con leucemia mieloide crónica y es el resultado de la translocación de una porción del gen bcr desde el cromosoma 22 al 9, donde se ubica junto al oncogén c-abl. La consiguiente activación de este último, que codifica para una enzima denominada tirosina quinasa, parece ser el desencadenante de la enfermedad. La técnica PCR es especialmente útil, en este caso, para detectar la presencia de ARN mensajero híbrido bcr/abl. El ARN es analizado mediante la ya mencionada técnica RT-PCR, con primers específicos que revelan la presencia de mensajeros normales o híbridos. En pacientes sometidos a quimioterapia, la gran sensibilidad del método lo hace ideal para identificar poblaciones residuales de células cancerosas no detectables mediante técnicas convencionales, de manera tal que permite diagnosticar tempranamente un nuevo avance de la enfermedad.

Figura 3. La proteína alterada en los enfermos que padecen fibrosis quística carece del aminoácido fenilalanina N°508. Esto se debe a la mutación denominada DF508. El diagrama muestra la reconstrucción del genotipo de un paciente. En este caso, el padre (P) y la madre (M) son portadores tanto del gen normal (blanco) como del gen mutado (negro); lo mismo ocurre con la hija (H1). Los hijos varones son portadores de sólo un tipo de gen: el normal en el caso de H2y el mutado en el caso de H3. La técnica PCR (dot blot; véase la figura 2) revela la presencia de los oligonucleótidos característicos.

Se han implementado métodos que utilizan la PCR destinados a la evaluación del riesgo de padecer trastornos autoinmunes (perturbaciones debidas a agresiones "erróneas" realizadas por las defensas inmunitarias a órganos del propio paciente), tales como diabetes de tipo I, enfermedad celíaca, pénfigo vulgaris, miastenia gravis y esclerosis múltiple. Consideremos brevemente algunas situaciones vinculadas con los genes del llamado complejo mayor de histocompatibilidad (HLA), los cuales codifican para una serie de glicoproteínas de la membrana celular que participan en la iniciación de la respuesta inmunitaria. Cada uno de estos genes presenta numerosas variantes (alelos) en la población. Se sabe que la presencia de algunos de esos alelos en un individuo está asociada a la aparición de ciertas enfermedades autoinmunes. La reciente determinación de la secuencia de nucleótidos de varios alelos HLA permitió el diseño de nuevas estrategias de tipificación molecular de los genes HLA basadas en la amplificación por PCR y en la posterior hibridación con sondas constituidas por oligonucleótidos de secuencia específica que reconocen las variantes de alelos llamadas de riesgo. En colaboración con M. Herrera, M. Pando, V. Bernath y R. Gutman hemos desarrollado recientemente pruebas de tipificación por PCR de los alelos HLA que han indicado la existencia de susceptibilidad genética en relación con la enfermedad celíaca y la diabetes tipo I (insulinodependiente). En individuos blancos argentinos, determinados alelos HLA-DQ confieren treinta veces más riesgo de padecer estas patologías y su detección en familiares de afectados permite adoptar conductas terapéuticas tempranas.

La fuente de la cual procederá el ácido nucleico que se ha de utilizar como molde depende de cada caso: en patologías infecciosas se procesa el tejido donde se desea detectar el agente; en patologías oncológicas se estudian biopsias del tumor; para el diagnóstico prenatal de enfermedades hereditarias se analizan células del líquido amniótico o vellosidades coriónicas junto con el ADN de leucocitos de los padres; para analizar ciertas características genéticas propias de cada individuo (por ejemplo, determinados alelos HLA, portadores heterocigotas sanos de enfermedades hereditarias recesivas) es útil cualquier célula con núcleo del organismo, empleándose habitualmente sangre periférica debido a su fácil obtención. Cabe señalar que la reacción también se ha realizado con éxito sobre ADN parcialmente degradado, extraído de tejidos fijados en formol e incluidos en parafina. Esto no sólo facilita la obtención de muestras de piezas quirúrgicas, sino que permite realizar estudios retrospectivos sobre preparados histológicos de archivo. También es posible extraer ADN de huesos, amplificarlo mediante la técnica PCR y analizarlo con fines tan diversos como la identificación de cadáveres o la determinación de los defectos genéticos que padecían nuestros antcpasados remotos.

Uno de los problemas más evidentes que presenta esta técnica, sobre todo cuando se la utiliza cono herramienta de diagnóstico, es la posible generación de resultados falsamente positivos. Podría llegar a indicar, por ejemplo, la presencia de secuencias virales en personas no infectadas. Esto es consecuencia de la extrema sensibilidad del método. Los falsos positivos pueden generarse por contaminación de una muestra a partir de una única molécula de ADN proveniente de otra muestra. Esta molécula será amplificada en la PCR y aparecerá como una banda en el caso de electroforesis en gel o como una respuesta positiva en una hibridación con una sonda radiactiva. La causa más frecuente de falsos positivos es el "arrastre" de secuencias de ADN amplificadas en reacciones previas. Tales secuencias pueden estar presentes en los equipos de laboratorio y en los reactivos, pudiendo esparcirse por medio de aerosoles. Frente a esto, los expertos recomiendan la realización de controles negativos múltiples (reacciones de amplificación con todos los reactivos, excepto el ADN molde), además del uso de técnicas de esterilidad y de micropipetas que eviten la generación de aerosoles como precaución para preveni la contaminación de las muestras.

La PCR se ha sumado a la lista de desarrollos tecnológicos originados en el ámbito industrial que provocaron cambios cualitativos en las ciencias básicas. Uno de los proyectos más ambiciosos de la biología moderna es la determinación de la secuencia completa del genoma humano. Esto permitirá no sólo identificar los genes responsables de numerosas enfermedades hereditarias y trastornos metabólicos, sino descubrir nuevos genes y sus funciones celulares relacionadas. Un paso indispensable para concretar dicho objetivo consiste en realizar un "mapeo" del genoma, es decir, una especie de carta geográfica que permita ubicar los genes con cierta precisión a lo largo de los cromosomas. La PCR se ha revelado corno una de las técnicas de apoyo fundamental en tal empresa. Así por ejemplo. un grupo de investigadores de la pujante compañía francesa Genethon ha logrado diseñar recientemente corea de 1.000 pares de primers que han permitido "mapear" aproximadamente el 90 % del genoma humano.

En otro orden, el uso de la PCR puede llegar a cambiar aspectos de la vida del hombre tales como la planificación del sexo de los hijos. En forma piloto, ya se ha utilizado PCR para determinación prenatal del sexo después de fertilización in vitro. Con la ayuda de un micromanipulador es posible remover una única célula de un embrión de 10 células, sin afectar el normal desarrollo de las restantes. A partir del ADN de la célula aislada, y en menos de 24 horas, una PCR de 60 ciclos, realizada con primers que reconocen secuencias exclusivas del cromosoma Y (ausente en las mujeres) permite diagnosticar el sexo del embrión, para luego implantarlo en la madre. Este procedimiento ha sido utilizado clínicamente para familias con riesgo de padecer enfermedades hereditarias que se manifiestan casi exclusivamente en los varones, con el fin de seleccionar embriones hembra para la implantación. La extensión de este procedimiento a familias sin antecedentes de enfermedades hereditarias, con el simple objetivo de "elegir" el sexo del niño, es sin duda una cuestión ética sumamente polémica.

A través de las ciencias básicas, el uso de la PCR se ha diversificado y han surgido variantes del diseño original cuya descripción excede los propósitos de este artículo. Quizá la prueba más contundente de la trascendencia del invento y de su futura expansión sea la venta de su patente por aproximadamente 300 millones de dólares a la poderosa multinacional Hoffmann-La Roche.

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