Estas reacciones suelen efectuarse inmovilizando y reteniendo los ácidos nucleicos de la muestra sobre una membrana de nitrocelulosa o nylon, procedimiento conocido como "transferencia" o blotting (véase la figura 3). Posteriormente, la membrana es puesta en contacto con una solución en la que se encuentra la sonda marcada. Para que se produzca la hibridación deben cumplirse ciertas condiciones vinculadas fundamentalmente con: a) las concentraciones relativas de los ácidos nucleicos; b) la concentración de sales; c) la desorganización de la estructura de los ácidos nucleicos a fin de que sus bases queden expuestas y puedan reaccionar con las bases complementarias de las sondas (proceso denominado "desnaturalización", que en el caso del ADN implica la separación de sus dos cadenas); d) la temperatura; e) el marcado de una de las secuencias para detectar y cuantificar la reacción.

Fig.3. Las sondas de ácido nucleico se utilizan habitualmente siguiendo un procedimiento que consta de los siguientes pasos: extracción de los ácidos nucleicos de una suspensión celular; separación por digestión con enzimas adecuadas y electroforesis en gel de agarosa; transferencia (blotting) a una membrana de soporte de nitrocelulosa o nylon e hibridación sobre la membrana con la sonda marcada.

Mediante el control de estas condiciones, particularmente de la concentración de sales (astringencia), se puede llegar a regular el grado de precisión con el que han de ser "reconocidas" las secuencias durante la hibridación: en condiciones de máxima astringencia, estas reacciones son totalmente específicas, reconociéndose tan solo las secuencias complementarias de la sonda empleada.

La sensibilidad del ensayo estará dada por la cantidad absoluta de secuencias que queremos detectar en la muestra y por la intensidad de las señales del elemento con el cual hemos marcado nuestra sonda para poder identificarla. Para cumplir esta función se emplean sea isótopos radiactivos (tritio, fósforo-32, azufre-35 o iodo-125), sea biotina o digoxigenina unidas a complementos coloreados, luminiscentes o magnéticos. Los sistemas actuales están en condiciones de detectar cantidades absolutas muy por debajo del nanogramo de ADN (1 nanogramo = 1/1.000.000.000 de gramo). Las diferentes maneras de marcar losácidos nucleicos empleados como sondas ya han dado lugar a un activo campo de investigación. Hasta el momento se han desarrollado diversos tipos que se agrupan bajo las denominaciones de "calientes" o "frías", según utilicen, o no, productos radiactivos. Como puede apreciarse en la figura 4, las marcas difieren tanto en cuanto al tipo de señal que proveen (radiactiva, coloreada, luminosa o magnética) como al tipo de unión entre el elemento que da lugar a la señal y el fragmento de ácido nucleico.

Fig.4. Algunas de las formas más frecuentes de marcación y detección de los ácidos nucleicos que se emplean como sondas. En (a) un isótopo radiactivo se une al fragmento de ADN; la consecuente emisión de radiación a o b puede imprimir una placa sensible (autorradiografia). En (b) y (c), a través de biotina y estreptavidina, o bien de la digoxigenina y un anticuerpo que la reconoce, la enzima fosfatasa alcalina marca la sonda dando lugar, con su presencia, a un cambio de color del reactivo azul de tetrazolio (reacción coloreada). En (d) la biotina, con la ayuda de la estreptavidina, permite ligar una partícula magnética que puede ser separada, junto con la sonda, mediante el empleo de un imán (separación magnética); en (e) y (f), la peroxidasa, unida al ADN en forma directa o a través de fluoresceina y un anticuerpo, da lugar a la emisión de luz mediante el empleo del reactivo luminol (reacción luminosa).

Figura 5: Hibridación in situ, sobre cromosomas meióticos de grillo, de una sonda obtenida por clonamiento de secuencias repetitivas de la misma especie. Se demuestra la localización específica de las mismas por la tinción positiva sobre los extremos (telómeros, flechas) de la mayoría de sus cromosomas. La marcación y la detección fue realizada con el método (b) de la figura 4. (De un trabajo de Wettstein, Stoll y col.)

Cuando las sondas no se emplean sobre ácidos nucleicos retenidos en una membrana por transferencia, sino que son puestas directamente en contacto con preparados citológicos o histológicos, nos encontramos ante lo que se conoce como hibridación in situ. Esta modalidad permite localizar en forma muy precisa, a nivel de la célula o de sus componentes, las secuencias específicas complementarias de la sonda empleada. La figura 5 que muestra un resultado obtenido por el autor en colaboración con M. Stoll, pone de manifiesto la localización de secuencias en los extremos cromosómicos (telómeros) de un ADN repetitivo.

Debemos considerar ahora como se preparan las sondas. Ellas se generaban, inicialmente, mediante el aislamiento de fracciones de ácidos nucleicos naturales que luego se marcaban. En la actualidad, las técnicas del ADN recombinante de la ingeniería genética permiten insertar un fragmento de ácido nucleico en el ADN de un vector, por ejemplo un virus, el cual, al reproducirse, reproduce también el fragmento de interés.

Surgió así el método de producción de sondas por: a) inserción de fragmentos de ADN en vectores que por sus características (el citado caso del virus, que se reproduce mucho y en poco tiempo) permiten obtener gran cantidad de ADN con las características deseadas, b) la separación posterior (optativa) del inserto, c) el marcado del mismo.